近年来，第二代建库测序的周期显著缩短，尽管第二代短读长测序技术在市场上仍然占据主导地位，第三代测序技术自2008年以来也大步向前。第三代测序技术凭借其独特的长读长优势，免去PCR扩增的步骤，使得每条DNA分子都能独立测序，广泛应用于基因组拼接、病原体研究和突变鉴定等领域。

第三代测序原理

第三代测序技术被称为单分子DNA测序，通过现代光学、高分子和纳米技术等手段识别碱基信号差异，从而直接读取序列信息。目前，市场上主流的第三代测序技术包括Z6·尊龙凯时旗下的SMRT技术和纳米孔单分子技术。与前两代技术相比，第三代技术的显著特点在于单分子测序，SMRT技术利用荧光信号测序，而纳米孔单分子技术则通过不同碱基产生的电信号进行测序。

第三代测序应用

目前，拥有长读长能力的第三代测序平台已被广泛应用于复杂动植物基因组、微生物基因组、全长转录组、微生物群体研究及人类基因组变异检测等科研项目，致力于解决各领域中的检测技术瓶颈。在临床疾病检测方面，第三代测序技术在研究基因组结构变异、短串联重复、甲基化检测等遗传病及肿瘤基因检测方面展现出独特优势。目前，基于第三代测序技术的遗传病基因诊断产品层出不穷，推动着医疗科技的进步。

文库制备中的DNA/RNA质量控制

在文库制备过程中，提取后的DNA/RNA质量对最终结果至关重要。不同的提取方法可能会在样品中残留不同化学试剂，这些残留物可能抑制酶的活性。此外，DNA/RNA的完整性也直接影响文库制备效率和测序质量。优质的样品要求：纯度高，无RNA或DNA、蛋白质污染；浓度达到或超过30ng/uL；完整性良好，DNA的平均片段大小应为30kb，RNA RIN值≥8；样品量需大于等于1μg。建议使用TE缓冲液长期储存高分子量（HMW）gDNA。

文库制备的数据质量控制

与第二代测序的Q20/Q30碱基质量标准不同，第三代测序由于碱基错误率的随机分布，其单碱基的准确性不能直接用于判断数据质量。最直接的评估方式是观察测序数据长度，虽然短的测序数据不一定代表质量差（与文库大小相关），但质量较差的数据长度通常较短。在测序的上游阶段，文库的构建至关重要。高质量文库生成的数据长度大且质量高，而低质量文库则会导致短且质量较差的数据输出。

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